科研进展丨质子化调控的多肽插膜动力学：亚稳态分子构象及其转变
细胞膜与内源性和外源性分子的复杂相互作用是多种生物过程的基础，也为医疗发展提供了重要依据。其中，pHLIP多肽因其独特的pH响应特性成为研究分子跨膜机制的理想模型——它能在不破坏膜结构的情况下实现跨膜插入，在癌症诊断和药物递送领域具有广阔应用前景，目前多个变体已进入临床前测试阶段。近期研究利用停流圆二色谱、荧光光谱和固态核磁共振等技术，在揭示pHLIP跨膜插入途径方面取得突破，特别是发现了插入过程中的“中间态”及pH依赖的“热力学中间态”。然而，这些系综技术难以精确定位膜内中间态的位置、停留时间及其与热力学态的关联，也无法捕捉单个肽分子的动态变化。
为此，松山湖材料实验室生物界面团队与纳米生物材料团队合作，基于其近年来发展的单分子荧光技术（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2019, 58 (17), 5577），首次在单分子尺度上揭示了质子化调控的pHLIP构象转变及跨膜动力学过程。他们通过实时追踪野生型pHLIP及其三种变体的跨膜转运，鉴定出三种膜内"亚稳态构象"，并阐明了这些构象在插膜过程中的动态转换机制。研究发现，这些转变源于质子化肽与脂质微环境的相互作用，且可通过C端可质子化残基进行调控。该研究不仅揭示了残基质子化对分子构象及其跨膜动力学的影响，还为药物递送系统设计提供了新思路，相关成果已发表于ACS Nano。松山湖材料实验室为该论文的第一单位。
图1. (a) pHLIP多肽的序列；(b) 当前相关研究中面临的主要问题；(c) 借助LipoFRET技术，可通过单分子荧光强度的变化实时获取单分子跨膜深度的具体位置信息；(d1,d2) pHLIP多肽的N端与C端在细胞膜内呈现动态平衡状态
图2. (a) 实验设计的示意图；(b1-d1) 在将 pH 值从 7.4 调节至 5.0 后，分别于 0-3 分钟、3-6 分钟及 6-9 分钟时间段内捕获的代表性荧光强度曲线；(b2-d2) 上述时间区间内对应的荧光强度统计分布图；(b3-d3) 展示 C-pHLIP 在双层膜不同 z 深度之间转换的跃迁密度分布图；(b4-d4) 插膜态转变过程的示意图
图3. (a)三种变体的序列；(b1,b2) 在pH 5.0条件下，野生型多肽及其三种变体在细胞膜内的亚稳态插膜深度与比例；(c,d) 多肽在pH值调节过程中膜插入状态的时间演变过程；(e)多肽逐渐渗透进入膜内的示意图
图4. 质子化驱动pHLIP构象变化及插膜动力学过程示意图